1、加热排气
打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀。
2、保温保压
当锅内压力升到1Kg/cm2时，控制热源，维持压力至15分钟。
3、出锅
切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。否则会因锅内压力较高，打开气阀后造成的压力差可能使容器内的培养基喷溅造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至使容器爆炸。
4、处理
灭菌后，通常将实验用具放入60℃~80 ℃烘箱中烘干，以除去灭菌时的水分，避免引起污染。
注意事项：
1、物品放置的要求整齐、稳定。并需要留出空隙。
2、加盖时将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内，在一两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
3、灭菌结束时打开灭菌锅盖时，注意不要把脸靠近，否则蒸汽会对脸造成伤害。
湿热灭菌柜抽真空抽到负多少千帕
小型预真空灭菌器需要每天做BD测试，具体参照的是《医院消毒供应中心——第3 部分:清洗消毒及灭菌效果监测标准》。
压力蒸汽灭菌B-D测试方法：
具体作法是:B-D测试包由100%脱脂纯棉布折叠成长30cm±2cm、宽25cm±2cm、高25cm～28cm大小的布包裹；将专门的B-D测试纸，放入布测试包的中间；测试包的重量为4kg±5%或用一次性B-D测试包。B-D测试包水平放于灭菌柜内灭菌车的前底层，靠近柜门与排气口底前方；柜内 除测试包外无任何物品; 134℃，3.5min～4min后，取出B-D测试纸观察颜色变化，均匀一致变色，说明冷空气排除效果良好，灭菌锅可以使用；反之，则灭菌锅有冷空气残留，需检查B-D测试失败原因，直至B-D测试通过后该锅方能使用。
负85千帕。根据查询仪器信息网显示，湿热灭菌柜通过抽真空使室内压力为负90千帕，保持10分钟，10分钟以内不得低于负85千帕。湿热灭菌是利用机械抽真空的方法，使灭菌柜室内形成负压，蒸汽得以迅速穿透到物品内部进行灭菌。